“Анализ – это статистическая вероятность обнаружения чего-то.”
Вашу птицу посмотрели, потрогали, и даже сделали ей рентген. Как правило, после рентгена мы слышим про какие-нибудь затемнения, разлитые, односторонние и двусторонние пневмонии, артриты, артрозы, оститы, гастриты и прочие страшные слова – возникает закономерные вопросы – “что это за звери, и как их лечить?”
Исходя из находок на рентгене, допроса владельца и осмотра птицы, врач собирает это все воедино – так рождаются дифференциальные диагнозы, которые нужно подтвердить или опровергнуть лабораторными анализами.
Многие люди снаружи и внутри ветеринарной медицины склонны думать, что анализы решают всё. Так устроен наш мозг: нам нужно больше уверенности в будущем и гарантий. Чем их больше, тем легче жить и планировать. Анализы – это такой условный маячок гарантий, за который легче всего уцепиться, чтобы действовать, исходя из чего-то “объективного”. Но так ли объективны лабораторные анализы, как может казаться людям, далеким от лабораторной диагностики?
Итак, в медицине птиц я и многие коллеги используем два основных варианта анализов, чтобы выяснить инфекционный статус птицы: ПЦР-тесты и микробиологические посевы.
Судя по анализам – абсолютно здоровая птица с самоощипом. Из выявленных патогенов – кровепаразиты, но их недостаточно, чтобы вызвать такой масштаб самоощипа и патологий на рентгене.
ПЦР – полимеразная цепная реакция.
Про ПЦР можно рассказать много: это сложный процесс, в который с первого раза трудно вникнуть даже врачам, поэтому в этой статье я постараюсь всё объяснить как можно более простым языком, не вдаваясь в лишние детали.
ПЦР делается на основе оборудования и тест-систем к нему, которые производят разные компании, а иногда даже сами лаборатории делают их себе сами. Тест-системы включают в себя реагенты, способные отлавливать конкретных представителей инфекционных заболеваний. Например, тест-система для определения микоплазм и для определения сальмонелл – это две разные коробочки, порой от разных фирм.
Специальные вещества в составе тест-систем для ПЦР отлавливают специфическую ДНК и РНК, даже если она валяется там изуродованными неузнаваемыми кусочками – в таких случаях вещества тест-системы пытаются воссоздать геном патогена из его “обломков”, и, когда этот Франкенштейн создан – тест-система по нему делает вывод, был ли искомый патоген в материале, и насколько получившийся зомбак похож на того, которого мы искали, и рассказывает об этом врачу ПЦР-диагностики.
Тест-система находит как цельные и хорошо узнаваемые кусочки генома патогена, так и абсолютно непонятные на первый взгляд фрагменты. Легкость обнаружения и состояние генома зависит от свойств искомого патогена и биоматериала в котором он находится.
Казалось бы, способ надежный, как швейцарские часы. Но…
Важен материал, который сдается на посев. Инфекции птиц часто генерализованы (распространены по всему организму), но в каком материале патоген станет накапливаться больше всего в достаточном для обнаружении количестве – это большой вопрос. Пример по реальному случаю: у нас есть бибочка на суставчике, и есть респираторный комплекс проблем. Мы подозреваем микоплазмоз, сдаем комплекс: и общеродовая микоплазма (то есть, “анализ! покажи мне, есть ли там хоть какая-нибудь микоплазма…”), и другие микоплазмы, опасные для животных. По помету нам говорят что да, какая-то микоплазма точно есть – общеродовая положительна, но она какая-то не из нашего списка, потому что они – отрицательны. В том числе отрицательна синовиальная микоплазма, которая очень часто вызывает поражение суставов, и которую стоит подозревать в первую очередь в случае с бибочкой на суставе. Если мы сможем взять материал с сустава – чаще всего, это пунктат – то мы получаем положительный результат на синовиальную микоплазму. Почему так?.. в следующем пункте.
Важно качество материала и его состав. Например, материал “помет” содержит в себе довольно много различных составляющих, которые могут влиять на процесс проведения теста и обнаружение кусочков генома. Грубо говоря, помет становится гигантским стогом сена, а ДНК\РНК – иголкой в ней.
Это становится проблемой, если мы знаем, что единственный вариант поймать нужную нам инфекцию прижизненно – возможно только через помет, потому что второй вариант – это отправлять непосредственно кусочки органов на анализ – то есть, посмертно. Такая ситуация происходит с животрепещущим для многих владельцев попугаев анализом на микобактериоз – мало того, что сами микобактерии выделяются неравномерно (если выделяются вообще, а не прячутся в гранулемах безвылазно, при этом продолжая вызывать поражение органов), так они еще и умело прячутся в самом материале, единственно доступном нам для сдачи на этот анализ, пока птица жива.
Возвращаясь к примеру с микоплазмой, живущей в суставе: из-за концентрирования инфекции в органах-мишенях тест-система может не уловить специфичность (уникальность) генома, но обнаружить его присутствие, тем самым выдав результат: “микоплазма есть, но какая – не понял, геном был тухлый и зомби собрался непонятный, поэтому вот вам микоплазмоз общеродовой положительный, но насчет остальных я не уверен”. Помимо этого, птица может болеть несколькими видами микоплазм: в респираторной системе – какая-нибудь из не сильно патогенных (и потому по ПЦР у нас только “общеродовая”), которую легко отловить через мокроту и помет, а в суставах относительно безвылазно сконцентрирована m.synovia (и поэтому поймать ее “за руку” возможно, только получив материал из места ее концентрации). Казалось бы, банальный микоплазмоз – а сколько нюансов! Не хватит небольшой статьи, чтобы описать все эти нюансы для каждого патогена. А еще накладывается то, что в работе есть человеческий фактор и разные тест-системы…
Важно то, сколько материал ждал своего момента. Например, борнавирус, по последним данным – умирает в материале за 4-6 часов. Организовать доставку материала под запуск ПЦР в лаборатории весьма проблематично, поэтому получить ложноотрицательный результат на борнавирус легче в разы, чем положительный. Справедливости ради, большая часть патогенов все-таки успешно доживает до лаборатории, но если врач или владельцы не знают специфики искомого патогена – упустить этот момент очень легко.
Поэтому ПЦР-тесты всегда про “мы нашли\мы не нашли”, а не про количество патогена, его свойства и окончательный диагноз. Что важно, сам создатель ПЦР-метода, Керри Мулис, говорил, что ПЦР не может и не должен быть окончательным вариантом постановки диагноза:
Также про мифы ПЦР есть замечательная лекция для врачей от заведующей отделением ПЦР лаборатории “Поиск”:
Микробиологические посевы.
Второй наш самый доступный и распространенный вариант поискать патогенные микроорганизмы в птице – это микробиологический посев. Он предназначен ТОЛЬКО для выявления бактерий или грибов – все другие братишки пройдут незамеченными.
Суть его изложить намного проще: стерильным зондом мы берем мазок с места, где предполагаем поймать подозреваемых: это могут быть как слюни, так и помет, так и кусочки органов. Все это помещается в специальную пробирку с транспортной средой, которая блокирует рост микрофлоры: это исключает контаминацию (загрязнение) уже взятого образца. А загрязнить при желании его может кто и что угодно: от безобидного стафилококка, упавшего случайно с попных перьев птицы, до микрочастицы слюны владельца, радостно выдохнувшего после взятия мазка из клоаки.
В лаборатории материал “высевается” как урожай, на специальную питательную среду, которая будет стимулировать рост микроорганизмов, которые переехали с зонда на среду живыми. После активного роста культур, лаборант смотрит на них под микроскопом, и по их морфологии определяет, что это за покемоны. Выросшим культурам показывают различные образцы антибиотиков и антимикотиков, и исходя из реакции на них – делают выводы о чувствительности этих культур к группам препаратов. Так мы в результате анализа получаем бланк, в котором указано: как зовут наших друзей, сколько их выросло, чего боятся и чего не боятся из лекарств.
Выглядит легко, но…
Во-первых, уже упомянутая – контаминация. Со стороны человека, берущего анализы, максимально важно соблюдать правила стерильности и не допускать на зонд ничего лишнего, кроме целевого материала, чтобы случайно не вышел “посев с поверхности клетки”. Как правило, транспортные среды испортить очень трудно, и длительность хранения материала в пробирке практически не ограничена, если соблюдать температурный режим – здесь посевы, в отличие от ПЦР, дают нам фору. Но при попадании материала в лабораторию крайне важна добросовестность отдела микробиологии и их надежные, как скалы, протоколы стерилизации – поэтому не нужно удивляться, если ваш врач не согласен сдать посев в первую попавшуюся лабораторию.
Во-вторых, компетенция лаборанта или лаборантки, отсматривающих выросшие культуры. Не секрет, что у каждого вида животных в разрезе какой-либо диагностики есть свои референсные нормы. У птиц – одни, у млекопитающих – другие. Поэтому если лаборант даже краем уха не слышал о специфике бактериального и грибкового фона птиц, он может “пропустить” важную выросшую культуру или ее свойство.
По части сельскохозяйственного направления найти данные несложно, но для определения патогенов птиц-компаньонов нужно “быть в теме” актуальных исследований и иметь возможность что-то уточнить у практикующих коллег.
Например, была и есть огромнейшая проблема при диагностике аспергиллеза таким методом, ведь по обычному протоколу, если во всем ассорти чашки Петри вырастают плесневые грибы, они считаются контаминацией – мусором – и на выходе не учитываются как диагностически ценный результат – их не будет в бланке, их не протестируют на чувствительность к антимикотикам. Хотя именно плесневые грибы, выделяющиеся из помета, являются прямым подтверждением наличия критической проблемы аспергиллеза у птицы. Проблема актуальна до сих пор, хотя плесневые грибы стали периодически появляться в результатах лабораторий, с которыми мы сотрудничаем чаще всего.
У птицы с признаками аспергиллеза на рентгене, симптомами аспергиллеза, быстрорастущей плесенью в помете и положительной реакцией на препараты-антимикотики ни разу не высеивалась культура грибов, даже когда мы сдавали пробирку в таком виде с пометкой “птица больна аспергиллезом”. Судя по анализам – аспергиллеза у птицы нет.
В-третьих, уникальность мира бактерий и невозможность охватить всё их разнообразие одним анализом. Как я упомянула выше, рост бактерий культивируется на специальных питательных средах. Учитывая уникальные свойства разных семейств, для выращивания определенных патогенов нужны среды с уникальными свойствами и\или ингибиторами (стимуляторами) роста. Посев, который доступен нам в лабораториях за оптимальные деньги и сроки, не может отобразить, например, все те же микоплазмы и микобактериоз, даже если в материале от птицы их присутствие огромно, потому что они растут на специально разработанных для них средах и при других условиях, а для некоторых из патогенов нужны специальные государственные разрешения, чтобы иметь право их выращивать у себя в лаборатории.
В-четвертых, не все бактерии, которые могут вызывать патологические процессы в птице, могут попасть на зонд или вырасти на питательной среде. К сожалению, эти товарищи не спешат явить себя и прыгнуть на зонд, куда бы мы его ни засунули. Порой бывает так, что истинный источник кашля, соплей и некрасивых затемнений на рентгене – находится относительно недвижимо внутри тканей органов или плотно запакованных гранулемах, слабо циркулируя по организму птицы и скудно выделяясь в окружающую среду.
Понятное дело, в таком случае, патоген в посеве не отразится – его попросту невозможно поймать еще на стадии взятия материала.
Также нередко бывает, что в птице соседствует одна, две или несколько патогенных культур, которые конфликтуют между собой, подавляя рост друг друга – тогда даже несмотря на недомогание птицы от их взаимодействия, в чашке Петри могут вырасти не все из них и даже не те, которые были бы действительно значимы.
Есть и технический неизбежный момент – транспортная среда, в которую помещается мазок, может слегка разбавлять образец, и этого “слегка” при низком количестве выделяемых бактерий может хватить, чтобы до лаборатории ничего не доехало.
В-пятых, описанное на бланке количество микроорганизмов и их свойства – описаны in vitro (в условиях “пробирки”), но in vivo (внутри организма, где происходит хардкор) все может происходить совершенно не так…
Про количество микроорганизмов в бланке и несостоятельность этой величины есть довольно подробное объяснение тут:
Вкратце – мазок изо рта, взятый на палочку, не может отразить реальное количество бактерий в гранулемах где-нибудь в нижней трети легкого. Это невозможно физически.
В условиях in vitro культуры выращиваются на специально созданной для них среде, избегая любых неприятных воздействий, чтобы культура выросла красивая и махровая, страшной жизни не знающая. Что не скажешь об условиях in vivo – даже самая безынициативная иммунная система в мире может задать жару любому патогену, который будет покушаться на ткани организма. Патогену приходится адаптироваться, приспосабливаться – зачастую они посреди боевых действий отращивают себе, допустим, дополнительную защитную капсулу и становятся устойчивы к привычным воздействиям.
За счет разного “уровня жизни”, говоря об одной и той же культуре из одного и того же пациента, результаты анализа и фактическая боевая мощь патогенных культур могут разниться – например, совершенно внезапно, подобранный по панели чувствительности антибиотик явно не воздействует на бактерии,так как они развивались по пути “сражайся или умри”, в отличие от своих тепличных собратьев из питательного бульона.
Поздравляю! Вы дошли до конца статьи и выжили.
Давайте подведем итоги.
Доверяйте своему врачу – он мозг спецоперации по спасению птицы.
В лечении птиц, помимо анализов, врачи также используют свой здравый смысл и клинический опыт, поэтому крайне неэффективно пытаться что-то диагностировать самостоятельно, активно читать интернет переписав с бланка имя обнаруженного гада, и сдавать “всё по списку лаборатории” – даже на моменте взятия анализов и передачи их в лабораторию существует огромное количество нюансов, и еще больше нюансов – при чтении бланка анализов.
Пазл не всегда складывается быстро.
Существуют финансовые и технические ограничения лабораторий, в которых никто не виноват, и которые нельзя разрулить быстро. Существует ограничения диагностических мощностей в рамках города, страны. Нам недоступны анализы ИФА для птиц, практически нигде нельзя сделать эндоскопию с биопсией материала, очень сложно сделать КТ и МРТ птице меньше 100гр, практически нет врачей-патоморфологов и развитой школы птичьей гистологии… можно перечислять бесконечно. Время, спрос и инициатива помогут решить эти проблемы. А пока…
Статьи и протоколы ведущих специалистов других стран – не всегда должны ставиться в углу стола.
Протоколы, написанные в одних странах, должны адаптироваться к возможностям других стран во имя здравого смысла.
Невозможно оставить без помощи очевидно страдающее животное, потому что его анализы пришли “чистыми”, как это бывает с аспергиллезом, а кроме уже сделанных анализов мы никак диагноз проверить не можем.
Невозможно игнорировать проблему только потому что она в стадии изучения, и ее тяжело диагностировать, как это выходит с микобактериозом. Через десять лет об этом наверняка заговорят по-другому, потому что…
Авторитетные статьи с полноценными исследованиями, вышедшие условно сегодня – были написаны в течение нескольких лет, и порой это большой срок – от года до двадцати. Но в те годы, когда эти статьи были в процессе, не было авторитетной информации по таким темам. Потому что она была в процессе подготовки к публикации 🙂 Источник актуальной информации для врача – это живой обмен опытом с коллегами. И многочисленные статьи, да.
Многие думают, что наука и медицина – это совершенная точность, без сомнительных результатов и неоднозначных выводов. Если о чем-то нет статьи, нет положительного результата анализа – значит, бред и не доказано, “попейте витаминки”. Но на самом деле, движущая сила науки и медицины – творчество, любопытство и энтузиазм. Без них не было бы открытий, которые сейчас являются непоколебимой базой знаний.
Благодарю за помощь в создании статьи своих коллег:
Юнусову Валентину, руководительницу отдела ПЦР-диагностики лаборатории Neovet за консультацию
Валентина Козлитина, ветеринарного птичьего врача – за редакцию статьи и многочисленные образовательные видео
Марину Валучеву, студентку и будущего птичьего врача за авторские рисунки о “сложностях поиска генома в тяжёлых условиях сборной пробы помета”